The Cystinosis Foundation and the French Association for Information and Research on Genetic Renal diseases (airg) organised a conference in Paris from 28 to 30





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WHY DO CYSTINOSIS KIDNEY CELLS NOT WORK PROPERLY?

William van’t Hoff, Renal Unit, Great Ormond Street Hospital, London, WC1N 3JH, UK

Recent research has identified the genetic abnormality and provided information on the lysosomal cystine transporter but the ways in which cystine accumulation causes kidney tubule cell damage or dysfunction (the Fanconi syndrome-FS) are still not known. Other workers have performed studies in animals and shown that rabbit kidney tubules loaded with cystine have defective transport as in FS. Cystine-loaded tubules have reduced energy levels (ATP) as well as reduced oxygen consumption and decreased metabolism. These data suggest impaired energy metabolism, a process that occurs in specialised parts of the cell, the mitochondria. However these studies have been performed in cells from healthy animals in which lysosomal cystine transport is functioning normally. The results may not therefore be relevant to cystinotic cells.

Lysosomes are formed from endosomes, which are involved in the regulation and metabolism of kidney tubular transporters. If these processes don’t work properly, kidney tubule transport could be affected, just as in FS. Two membrane receptors for this pathway (megalin and cubilin) have been described. Proteins in the urine (in the kidney tubule) bind to these receptors and are taken into the cell and processed by endosomes. The proteins are delivered to the lysosomal system and the receptors recycled to the plasma membrane. Mice in which the megalin gene has been ‘knocked-out’ demonstrate greatly increased urinary losses of low molecular weight proteins just as in FS. Proximal tubules of a mouse model of another cause of FS (Dent’s disease) show reduced amounts megalin and other transporters. There is therefore evidence that disruption of the endocytic pathway is a feature of a number of FS.

To further study cellular dysfunction in cystinosis, we and others have prepared an alternative model of cystinosis by culturing human proximal tubular cells derived from urine. We are using this model to study mitochondrial function and the endocytic pathway in cystinosis.

POURQUOI LES CELLULES RENALES NE FONCTIONNENT-ELLES PAS CORRECTEMENT DANS LA CYSTINOSE ?


William van’t Hoff, Unité du rein,, Hôpital Great Ormond Street, Londres, Royaume-Uni

Si des recherches récentes ont identifié l’anomalie génétique à l’origine de cette maladie et fourni des informations sur le transporteur lysosomial de la cystine, la façon dont l’accumulation de la cystine conduit à des lésions ou à un dysfonctionnement des cellules tubulaires rénales (le syndrome de Fanconi) reste encore inconnue. D’autres études réalisées chez l’animal ont permis de démontrer que des tubules rénaux de lapin chargés en cystine présentaient une déficience du transport comme dans le syndrome de Fanconi. Les tubules chargés en cystine ont des niveaux d’énergie réduits (ATP), ainsi qu’une consommation d’oxygène réduite et un métabolisme diminué. Ces données suggèrent une altération du métabolisme énergétique, un processus qui est localisé dans des éléments spécialisés de la cellule, les mitochondries. Cependant, ces études ayant été réalisées sur des cellules d’animaux sains chez lesquels le transport lysosomial de la cystine s’effectue normalement, leurs résultats ne sont peut-être pas pertinents pour ce qui est des cellules cystinosiques.
Les lysosomes sont formés à partir des endosomes, qui interviennent dans la régulation et le métabolisme des systèmes de transport tubulaires rénaux. Si ces processus ne fonctionnent pas correctement, le transport au niveau des tubules rénaux pourrait s’en trouver affecté, tout comme dans le syndrome de Fanconi. Deux récepteurs membranaires pour cette voie (la mégaline et la cubiline) ont été décrits. Les protéines présentes dans l’urine (dans les tubules rénaux) se lient à ces récepteurs puis sont incorporées dans la cellule, où elles sont traitées par les endosomes. Les protéines sont ainsi transportées vers le système lysosomial et les récepteurs sont recyclés vers la membrane plasmique. Les souris chez lesquelles le gène de la mégaline a été invalidé (knocked-out) présentent une forte augmentation de la perte urinaire de protéines de faible poids moléculaire, tout comme dans le syndrome de Fanconi. Dans un modèle de souris d'une cause différente de syndrome de Fanconi (maladie de Dent) les tubules proximaux montrent des taux réduits de mégaline et d’autres transporteurs. Il a été ainsi mis en évidence que l’interruption de la voie de l'endocytose est une caractéristique commune à divers types de syndrome de Fanconi.
Afin d’étudier plus en détail le dysfonctionnement cellulaire impliqué dans la cystinose, nous avons, en collaboration avec d’autres chercheurs, préparé un modèle alternatif de cystinose en cultivant des cellules tubulaires proximales humaines prélevées dans l’urine. Nous utilisons ce modèle afin d’étudier la fonction mitochondriale et la voie de l'endocytose dans la cystinose.


INTRA-LYSOSOMAL CYSTINE ACCUMULATION IN MICE LACKING CYSTINOSIN, THE PROTEIN DEFECTIVE IN CYSTINOSIS

Cherqui S., Sevin C., Hamard G., Kalatzis V., Sich M., Pequignot M.O., Gogat K., Abitbol M., Broyer M., Gubler M.C., and Antignac C.

Cystinosis is an autosomal recessive disorder characterized by an accumulation of intra-lysosomal cystine. The causative gene, CTNS, encodes cystinosin, a 7 transmembrane domain protein, which we recently showed to be the lysosomal cystine transporter.

We cloned and characterized the murine homologue of CTNS, Ctns, and the encoded amino acid sequence is 92.6% similar to cystinosin. We report the first Ctns knockout mouse model generated using the promoter trap approach. We replaced the last four Ctns exons by a IRES-gal-neo cassette and showed that the truncated protein was mis-localized and non-functional. Ctns-/- mice accumulate cystine in all organs tested, and cystine crystals, pathognomonic of cystinosis, were observed. Ctns-/- mice developed ocular changes similar to those observed in affected individuals, bone and muscular defects and behavioral anomalies. Interestingly, Ctns-/- mice did not develop signs of a proximal tubulopathy, or renal failure. The comparison of the two species may bring to light the cause of this pathology seen in children with cystinosis, the exact origin of which remains a major question. A preliminary therapeutic trial using an oral administration of cysteamine was carried out and demonstrated the efficiency of this treatment for cystine clearance in Ctns-/- mice. This animal model will prove an invaluable and unique tool for testing emerging therapeutics for cystinosis.
ACCUMULATION DE CYSTINE DANS LES LYSOSOMES DES SOURIS DEFICIENTES POUR LA CYSTINOSINE, PROTEINE IMPLIQUEE DANS LA CYSTINOSE

Cherqui S., Sevin C., Hamard G., Kalatzis V., Sich M., Pequignot M.O., Gogat K., Abitbol M., Broyer M., Gubler M.C., et Antignac C.

La cystinose est une maladie métabolique héréditaire rare de transmission autosomique récessive qui résulte d’un défaut de transport de cystine hors du lysosome dans lequel elle s’accumule et tend à former des cristaux. Le gène impliqué dans la cystinose, le gène CTNS, code une protéine de 367 acides aminés, la cystinosine, dont l'analyse de la structure primaire suggère qu'elle est composée de 7 domaines transmembranaires, de 7 sites de glycosylation dans sa partie N-terminale et d'un signal potentiel d'adressage aux lysosomes dans sa partie C-terminale, le motif GYDQL. Nous avons montré récemment que la cystinosine est une protéine de la membrane lysosomale, que c’est un transporteur de cystine et qu’il s’agit d’un symporteur cystine-proton.

Nous avons cloné et caractérisé le gène murin homologue du gène CTNS, Ctns qui code une protéine qui présente 92.6% de similitude avec la cystinosine humaine. Nous avons créé un modèle animal de cystinose par invalidation du gène Ctns. L’invalidation du gène a été réalisée grâce à la technique « promoter trap » consistant à remplacer par recombinaison homologue le gène endogène par le gène interrompu par une cassette gal-neo précédée d’une séquence IRES. Cette séquence permet la réinitialisation de la traduction et l’expression de la galactosidase et la résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur de Ctns. Nous avons ainsi remplacé les 4 derniers exons du gène Ctns et montré que la cystinosine ainsi tronquée n’est plus localisée aux lysosomes et ne transporte pas la cystine.

Les souris Ctns-/- accumulent la cystine dès la naissance dans les différents organes testés et des cristaux de cystine sont détectés à partir de l’âge de 6 mois dans la plupart des organes. Les souris Ctns-/- présentent des anomalies oculaires très similaires à celles retrouvées chez les enfants atteints de cystinose infantile, une déminéralisation osseuse, des anomalies musculaires et des troubles du comportement. Cependant, les souris Ctns-/- ne développent pas de tubulopathie ni d’insuffisance rénale. La physiopathologie de la tubulopathie dans la cystinose n’étant pas élucidée, nous espérons que la comparaison des cellules tubulaires proximales d’un point de vue biochimique et génétique chez l’homme et la souris, nous amènera à comprendre l’origine exacte de cette pathologie. Un essai thérapeutique a montré que la cystéamine était efficace chez la souris Ctns-/-. Ce modèle animal sera donc un outil important pour avancer dans la compréhension de la pathogénie de la cystinose et pour tester de nouvelles thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées que le traitement actuel.


CYSTINOSIS: FROM GENE TO PRACTICE

Corinne Antignac, Department of Genetics and Inserm U423, Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, France

Cystinosis is an autosomal recessive disorder characterized by an accumulation of intra-lysosomal cystine due to a defect in cystine transport across the lysosomal membrane (Gahl et al, 2001). Three clinical forms of cystinosis have been delineated based on severity of symptoms and age of onset. Infantile cystinosis is the most severe and is characterized by the appearance of a renal Fanconi syndrome at 6-12 months and the disease progresses, without treatment, to end-stage renal failure by 10 years. Other clinical signs appear (photophobia, hypothyroidism, hypogonadism, diabetes, neuromuscular anomalies) due to a widespread accumulation of cystine. Juvenile cystinosis is characterized by an adolescent onset of glomerular renal impairment and photophobia, without or with mild Fanconi syndrome. Ocular non-nephropathic cystinosis is solely characterized by a mild photophobia without any renal anomalies. The causative gene, CTNS, maps to 17p13, spans 23 kb of genomic sequence, and is composed of 12 exons, the first two of which are non-coding (Town et al, 1998). CTNS encodes a 367 amino acid protein, cystinosin, predicted to be composed of 7 transmembrane domains (TM) preceded by 7 N-glycosylation sites. Cystinosin is a lysosomal membrane protein and it is sorted via a tyrosine based GYDQL lysosomal sorting motif in its C-terminal tail, and a novel conformational lysosomal sorting motif in the 5th inter-TM loop, both of which are oriented toward the cytoplasm (Cherqui et al, 2001). The underlying metabolic defect of cystinosis is a defective efflux of cystine from the lysosome. We have recently shown that cystinosin is the lysosomal cystine transporter, and that this transporter is highly specific for L-cystine and is proton-driven. (Kalatzis et al, 2001a).

CTNS mutations have been detected in individuals affected with all of the aforementioned forms of the disease, demonstrating that these forms are allelic (Town et al, 1998; Shotelersuk et al, 1998; Thoene et al, 1999; Attard et al, 1999). The most common mutation underlying cystinosis is a large 57 kb (Touchman et al, 2000) deletion spanning exons 1 to 10 (Town et al, 1998). This deletion was detected in ~76% of affected northern European individuals and is due to a founder effect arising around the middle of the first millennium AD (Forestier et al, 1999). Two other founder mutations for cystinosis, accounting for elevated disease incidence in certain subpopulations, have been identified in Quebec, Canada (McGowan-Jordan et al, 1999) and in Brittany, France (Kalatzis et al, 2001b). Furthermore, it has been shown that, whereas patients with infantile cystinosis present with two severe CTNS mutations (such as the 57 kb deletion or mutations consistent with a loss of a functional protein), mutations occurring in patients with milder course of the disease (such as juvenile cystinosis or ocular cystinosis) have, at least, one mild mutation (missense mutation in a functionnally unimportant region of cystinosin or splicing mutation) associated either with a severe CTNS mutation or a mild one (Attard et al, 1999; Thoene et al, 1999; Anikster et al, 2000). Recently, mutations in the promoter region have also been described (Phornphutkul et al, 2001).

The search for mutations can be useful to confirm the diagnosis of cystinosis and to propose an accurate genetic counseling. Furthermore, the identification of the gene will help to better understand the pathophysiology of cystinosis and has allowed to create mouse models which will be useful to test new therapies for cystinosis.

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